Октябрь 2017, № 9 (209), стр. 91–95

doi: 10.25198/1814-6457-209-91

УДК: 579.25Сидоров Р.Ю., Ткаченко А.Г. ВЛИЯНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА REL ИЗ MYCOBACTERIUM SMEGMATIS НА АКТИВНОСТЬ RPOS-LACZ-СЛИЯНИЯ В ESCHERICHIA COLIГуанозинтетрафосфат (ppGpp) является важной регуляторной молекулой бактерий, вовлеченной в процессы стринджент-ответа, регуляции персистенции, адаптации к стрессу, патогенности. Белок Rel из Mycobacterium smegmatis ответственен за синтез и деградацию ppGpp. Исследование посвящено детекции внутриклеточного уровня гуанозинтетрафосфата при помощи генного слияния ppGpp-зависимого гена rpoS с репортерным lacZ применительно к штамму с экспрессионной плазмидой pMind::rel. Использованный метод оценки позволяет количественно определять низкие концентрации гуанозинтетрафосфата, что трудновыполнимо при использовании методов аналитической химии. На данный момент метод не разработан для микобактерий, поэтому возникает потребность в использовании подходов анализа микобактериальных ppGpp-синтетаз на кишечной палочке. В рамках исследования была сконструирована микобактериальная экспрессионная плазмида pMind с вставкой rel из Mycobacterium smegmatis. Полученная плазмида и исходный вектор были трансформированы в штамм со слиянием rpoS-lacZ. Культуры сравнивались путем измерения активности β-галактозидазы.
В штамме Escheriсhia coli, несущем плазмиду pMind с вставкой rel, было отмечено увеличение экспрессии rpoS по сравнению с контролем c плазмидой без вставки. Добавка индуктора экспрессии pMind тетрациклина не оказывала влияния на экспрессию rpoS.
Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о наличии экспрессии с промотора tetA в экспрессионной плазмиде pMind и сохранении ферментативной активности белка Rel из Mycobacterium smegmatis в Escherichia coli. Отсутствие тетрациклиновой индукции может являться следствием неспособности репрессора TetR из pMind связываться с регуляторными участками в Escherichia coli.Ключевые слова: гуанозинтетрафосфат, персистенция, экспрессионная плазмида pMind.

Загрузить

Список использованной литературы:

1. Миллер, Дж. Эксперименты в молекулярной генетике: пер. с англ. Зографа Ю.Н., Ильиной Т.С., Никифорова В.Г. под. ред. Алиханяна С.И. — М.: Мир, 1976. — 436 с.

2. Ткаченко, А.Г. Молекулярные механизмы стрессорных ответов у микроорганизмов. — Екатеринбург: УрО РАН, 2012. — 107 с.

3. Tetracycline-inducible gene regulation in mycobacteria / M.C. Blokpoel [et al] // Nucleic Acids Res. — 2005. doi: 10.1093/nar/gni023

4. The relA Homolog of Mycobacterium smegmatis Affects Cell Appearance, Viability, and Gene Expression / J. Dahl [и др.] // J. of Bacteriol. — 2005. — Vol.187. — No7. — P. 2439-2447.

5. Transcripion profiling of the stringent response in Escherichia coli / T. Durfee [и др.] // J. Bacteriol. — 2007. — P.1084-1096.

6. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology / V.Hauryliuk [et al] // Nature Reviews Microbiology. — 2015. — P.1-12. doi:10.1038/nrmicro3448

7. Maisonneuve, E. (p)ppGpp Controls Bacterial Persistence by Stochastic Induction of Toxin-Antitoxin Activity / E. Maisonneuve, M. Castro-Camargo, K.M. Gerdes // Cell. — 2013. — Vol. 154. — P.1140-1150.

8. Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual / T. Maniatis, M.R. Green, J.Sambrook // Cold Spring Harbor Laboratory Press. — Изд. 4-е. — P.32-34, 84-87, 119-122.

9. Simons, R.W. Improved single and multicopy lac-based cloning vectors for protein and operon fusions / R.W. Simons, F. Houman, N. Kleckner // Gene. — 1987. — Vol. 53. — No 1. — P.85-96.

10. Weiss, L.A. Essential Roles for Mycobacterium tuberculosis Rel beyond the Production of (p)ppGpp / L.A. Weiss, C.L. Stallings // J. of Bacteriol. — 2013. — Vol.195. — No. 24. — P.5629-5638.

11. BioCyc: Pathway/Genome Database Collection [Электронный ресурс]. — Режим доступа: https://biocyc.org, свободный.

О статье

Авторы: Сидоров Р.Ю., Ткаченко А.Г.

Год: 2017

doi: 10.25198/1814-6457-209-91

Главный редактор

Сергей Александрович
МИРОШНИКОВ

© Электронное периодическое издание: ВЕСТНИК ОГУ on-line (VESTNIK OSU on-line), ISSN on-line 1814-6465
Зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций
Свидетельство о регистрации СМИ: Эл № ФС77-37678 от 29 сентября 2009 г.
Учредитель: Оренбургский государственный университет (ОГУ)
Главный редактор: С.А. Мирошников
Адрес редакции: 460018, г. Оренбург, проспект Победы, д. 13, к. 2335
Тел./факс: (3532)37-27-78 E-mail: vestnik@mail.osu.ru